¹Universitätsmedizin Greifswald, Labor Innere Medizin A, Rheumatologie, Greifswald
²Universitätsmedizin Greifswald, Innere Medizin A, Rheumatologie, Greifswald
³Universitätsmedizin Greifswald, Greifswald
⁴UMass Cancer Center, Department of Biochemistry and Molecular Biotechnology, Worcester

Text

Einleitung: Störungen im Kalziumhaushalt sind mit zahlreichen humanpathologischen Zuständen assoziiert [1]. Unsere Daten zeigen erstmals, dass leicht erhöhte extrazelluläre Kalziumkonzentrationen nicht nur zur Inflammasomaktivierung [2], [3], [4], sondern auch zur Freisetzung von METs (Macrophage extracellular traps) durch humane Makrophagen führen. Diese Immunreaktion ähnelt der NETose neutrophiler Granulozyten, unterscheidet sich jedoch in den involvierten Pathways und den DNA-assoziierten Proteinen.

Methoden: Zur Analyse der METose wurden primäre humane Monozyten in Makrophagen differenziert und unter verschiedenen Bedingungen mit extrazellulärem Kalzium (exCa2+), LPS sowie spezifischen Inhibitoren (u.a. MCC950, AFM 30a, LDC7559) stimuliert. Die Bildung von METs wurde konfokalmikroskopisch, mittels Pico-Green Assay sowie durch Nachweis von Histon-Citrullinierung und Inflammasom-Aktivierung (GSDMD-Cleavage, ASC-Speck-Bildung, IL-1β-Freisetzung) charakterisiert.

Ergebnisse: Extrazelluläres Kalzium induziert die MET-Bildung unabhängig von TLR4-Stimulation und parallel zur NLRP3-Inflammasom-Aktivierung. Die Freisetzung der METs ist abhängig von PLC-Aktivität, mitochondrialer ROS-Produktion und einer PAD2-vermittelten Histon-Citrullinierung und erfolgt durch Plasmamembranruptur, nicht aber mittels GSDMD Poren-Formation. Unsere inhibitorischen Experimente mit MCC950 zeigen überraschenderweise, dass die Histon-Citrullinierung und DNA-Freisetzung durch NLRP3 Inhibition signifikant reduziert wird. Die Zusammensetzung der METs variiert je nach Differenzierungszustand der Makrophagen: GM-CSF-differenzierte MDM produzierten bakterizid potentere METs mit MMP12, wohingegen M-CSF-Makrophagen METs mit geringer bakterieller Abtötungskapazität ohne MMP12 freisetzten. Zudem lagert sich das Inflammasom-Adaptorprotein ASC an extrazelluläre DNA-Fasern an – ein bislang unbekannter Bestandteil von ETs.

Schlussfolgerung: Extrazelluläres Kalzium fungiert nicht nur als Auslöser für die METose, sondern gleichzeitig über eine Inflammasom-Aktivierung als Verstärker der angeborenen Immunantwort. Diese Erkenntnisse eröffnen neue Perspektiven für das Verständnis entzündlicher und insbesondere auch granulomatöser Erkrankungen. Zukünftige therapeutische Strategien, z.B. im Falle von granulomatösen Erkrankungen [5], könnten auf eine Regulation der METose abzielen.

References

[1] Walker MD, Shane E. Hypercalcemia: A Review. JAMA. 2022 Oct 25;328(16):1624-36. DOI: 10.1001/jama.2022.18331
[2] Rossol M, Pierer M, Raulien N, Quandt D, Meusch U, Rothe K, Schubert K, Schöneberg T, Schaefer M, Krügel U, Smajilovic S, Bräuner-Osborne H, Baerwald C, Wagner U. Extracellular Ca2+ is a danger signal activating the NLRP3 inflammasome through G protein-coupled calcium sensing receptors. Nat Commun. 2012;3:1329. DOI: 10.1038/ncomms2339
[3] Lee GS, Subramanian N, Kim AI, Aksentijevich I, Goldbach-Mansky R, Sacks DB, Germain RN, Kastner DL, Chae JJ. The calcium-sensing receptor regulates the NLRP3 inflammasome through Ca2+ and cAMP. Nature. 2012 Dec 6;492(7427):123-7. DOI: 10.1038/nature11588
[4] Murakami T, Ockinger J, Yu J, Byles V, McColl A, Hofer AM, Horng T. Critical role for calcium mobilization in activation of the NLRP3 inflammasome. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jul 10;109(28):11282-7. DOI: 10.1073/pnas.1117765109
[5] Sharma OP. Hypercalcemia in granulomatous disorders: a clinical review. Curr Opin Pulm Med. 2000 Sep;6(5):442-7. DOI: 10.1097/00063198-200009000-00010