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Ziel: Untersucht wurde der Einfluss von retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) auf die Entwicklung fibrotischer Veränderungen in der porzinen Glaskörperkultur als Modell der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR).

Methoden: Schweineaugen wurden am lokalen Schlachthof erworben, deren Glaskörper isoliert und auf Kollagen-IV-beschichteten Schalen in DMEM (1% FCS, 0,02% m-CSF) bis zu 16 Tage kultiviert und phasenkontrastmikroskopisch beobachtet. Nach Entfernung des Glaskörpers und der Netzhaut wurde das autologe RPE durch 0,25% Trypsin von der Aderhaut gelöst, in RPE-Medium (DMEM/Ham’s F12 1:1, 10% FCS, Insulin-Transferrin-Selenit) abzentrifugiert und das Pellet in Medium resuspendiert. Die Interaktion von Glaskörper und RPE wurde in vier unterschiedlichen Ansätzen untersucht: 1) Zugabe der frischen RPE-Suspension am Tag der Präparation (d0); 2) Zugabe der RPE-Suspension am Folgetag (d1); 3) Unterlegen des Glaskörpers mit einer konfluenten RPE-Kultur auf einem Coverslip an d1; 4) Kombination aus 2) und 3). RPE-Suspensionen enthielten präparationsbedingt neben RPE-Zellen stets auch freie Pigmentgranula. Anschließend wurden die Glaskörper für 8 oder 15 Tage kultiviert. Jeweils mindestens drei Präparate jedes Ansatzes wurden immunhistochemisch durch die Färbung von BEST1 (bestrophin 1) und SOX10 (SRY-related HMG-box 10; RPE-Marker), IBA1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1; Marker myeloider Zellen), α-SMA (alpha-smooth muscle actin; Myofibroblastenmarker) und Phalloidin an d8 und d15 nach Zugabe des RPE charakterisiert. Da die Zugabe der RPE-Zellsuspension am d0 (Ansatz 1) die stärkste fibrotische Reaktion hervorrief und der pathologischen Situation humaner PVR morphologisch am deutlichsten entsprach, folgten weitere Versuche diesem Protokoll. Die Immunzellmarker CD45, CX3CR1 und SLA-DR und der Fibroblastenmarker CD140a wurden durchflusszytometrisch erfasst. Die Entwicklung der Kulturen wurde nach Anfärbung von Glaskörperzellen mit CellTrackerTM Green in Zeitrafferaufnahmen beobachtet.

Ergebnisse: In allen Ansätzen wurden initial, vor Zugabe von RPE, verzweigte Hyalozyten der Glaskörperrinde beobachtet. Ab d4-5 entwickelten sich entlang der hinteren Glaskörpergrenzmembran einheitlich fibroblastäre Konglomerate, die an epiretinale Sternfalten erinnerten, wie sie bei humaner PVR beobachtet werden. Obwohl es sich bei der Mehrheit der beteiligten Zellen um pigmentierte Zellen handelte, waren diese an d8 immunhistochemisch negativ für RPE-Marker, positiv für IBA1 und teilweise positiv für α-SMA, was für eine Phagozytose von Pigment und die myofibroblastäre Transdifferenzierung von Hyalozyten spricht. An d15 waren in den strangförmigen Formationen immunhistochemisch keine Immunzellen und lediglich zum Teil pigmentierte fibroblastäre Zellen detektierbar, was mit einer weiteren Transdifferenzierung und einem Verlust der Immunzellidentität vereinbar ist. Diese Prozesse waren nach Zugabe von frischen RPE-Suspensionen an d0 (Ansatz 1) am stärksten ausgeprägt, während eine spätere Zugabe der RPE-Suspensionen (d1) keine starke Fibrose mehr auslöste. Auch durchflusszytometrisch war im Zeitverlauf eine Zunahme CD140a-positiver fibroblastärer Immunzellen (CX3CR1- und SLA-DR-positiv) an d15 zu beobachten. In der Lebendzell-Mikroskopie wurden verzweigte, pigmentierte a.e. Immunzellen identifiziert, die sich in gerichteten Strängen anordneten.

Schlussfolgerungen: In porzinen Glaskörperkulturen entstehen nach RPE-Aussaat entlang der ehemaligen Glaskörpergrenzmembran durch gerichtete Migration fibrotische Veränderungen, die dem klinischen Bild der epiretinalen PVR ähneln. Auffällig sind dabei pigmentierte Immunzellen, die morphologisch teilweise zusätzlich Myofibroblastenmarker exprimieren, und am ehesten transdifferenzierte Hyalozyten darstellen. Zudem zeigen sich nicht mehr auf ihren Ursprung zurückzuführende Myofibroblasten, was einerseits ein Verlust der Immunzellidentität im Laufe der Transdifferenzierung darstellen könnte oder für die Beteiligung weiterer Populationen, z.B. RPE-Zellen, an der Fibroseentwicklung spricht. Das Modell der porzinen Glaskörper-RPE-Mischkultur könnte zukünftig zur orientierenden Prüfung fibrosehemmender Therapiekonzepte dienen.