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Zielsetzung und Fragestellung: Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind vielversprechend für die Knorpeldefektregeneration. Üblicherweise differenzieren MSCs zu mineralisierenden Knorpelzellen, welche – analog zur enchondralen Ossifikation – ektop Knochengewebe ausbilden. Ihr klinischer Einsatz erfordert aber die gezielte Differenzierung in phänotypisch stabile, artikuläre Knorpelzellen. Dies gelang uns kürzlich erstmals subkutan im Mausmodel durch TGF-β-haltige Heparin-Hydrogele. In den Hydrogelen waren enchondrale Signalwege (WNT/β-Catenin, SMAD1/5/9) blockiert, was zur phänotypischen Stabilisierung der Knorpelzellen führte. Ziel dieser Studie war die In-vitro-Evaluierung der TGF-β-haltigen Heparin-Hydrogele und des Einflusses von Heparin auf die MSC-Chondrogenese. Die gezielte Steuerung der MSC-Entwicklung durch Heparin/TGF-β hat großes Potential die klinische Translation MSC-basierter Strategienfür die Knorpeldefektregeneration zu ermöglichen.

Material und Methoden: Humane Knochenmark-MSCs wurden in Heparin-Hydrogelen (22,4 mg/mL vernetztes Heparin, 120 ng TGF-β1) kultiviert oder als Hydrogel-freie 3D-Pellet-Standardkulturen mit löslichem Heparin (0, 10, 100, 700 μg/mL) in TGF-β1-haltigem chondrogenem Medium behandelt. Enchondrale Signalwege (0,5–3 h; 4 Wochen) sowie die Knorpelmatrixbildung (4 Wochen) wurden mittels Western Blot, Histologie, qPCR, ELISA und Enzymaktivität analysiert (n=3–5; Mann-Whitney-U-Test, p≤0.05).

Ergebnisse: Anders als in der subkutanen Umgebung differenzierten MSCs in Heparin-Hydrogelen in vitro in mineralisierende Knorpelzellen (Kollagen-X-Sekretion, alkalische Phosphatase (ALP)-Aktivität; Abbildung 1A [Abb. 1]). Um den isolierten Effekt von Heparin auf die MSC-Chondrogenese zu analysieren, behandelten wir dann mit löslichem Heparin ohne die störenden Hydrogelkomponenten, was eine unverminderte Bildung knorpeltypischer Matrix (Kollagen II, Aggrekan) ermöglichte. Die subkutan im Hydrogel ausgeschalteten enchondralen Signalwege waren nur zum Teil blockiert (WNT/β-Catenin: stark; SMAD1/5/9: moderat; Abbildung 1B–C [Abb. 1]). Damit im Einklang waren zwar viele Marker mineralisierender Knorpelzellen (MEF2C, ALPL, IBSP, ALP-Aktivität) signifikant unter Kontrollniveau gesenkt, aber nicht Kollagen X (Abbildung 1D–E [Abb. 1]). Zudem waren die Spiegel des knorpelprotektiven Prostaglandin E2 (PGE2) reduziert. Lösliches Heparin entfaltete somit eine selektiv Phänotyp-stabilisierende Wirkung, die im Vergleich zu etablierten Behandlungen (PTHrP-Puls, WNT-Inhibition) eine vergleichbare Wirksamkeit bei deutlich geringerer methodischer Komplexität und geringeren Kosten zeigte.

Diskussion und Schlussfolgerung: Während Heparin/TGF-β subkutan die MSC-Entwicklung in stabile Knorpelzellen erlaubt, entstanden in vitro mineralisierende Knorpelzellen. Unsere Ergebnisse unterstreichen damit die essenzielle Rolle des Mikromilieus für die Stabilisierung des Knorpelzellphänotyps durch Heparin/TGF-β und legen nahe, dass dafür die Hemmung der SMAD1/5/9-Aktivierung sowie PGE2 von Bedeutung sein können.