¹Rostock – Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Rostock
²Essen Abteilung für Chemie and Center für Nanointegration Duisburg-Essen (CENIDE), Universität Duisburg-Essen,
³Rostock – Institut für Zellbiologie, Universitätsmedizin Rostock

Text

Ziel: Bewertung ultrakleiner Goldnanopartikel (AuNP) als neuartiges Instrument für die Transfektion menschlicher Hornhautendothelzellen (EC): AuNP eignen sich aufgrund ihres Kerndurchmessers von lediglich 1–2 nm, ihrer chemischen Inertheit, ihrer Ungiftigkeit und ihrer hohen Transfektionseffizienz sehr gut für Anwendungen in der Biomedizin. Darüber hinaus wurde eine potenzielle therapeutische Anwendung durch die Verhinderung der EC-Apoptose untersucht.

Methode: Die Funktionalisierung der AuNP erfolgte mit Thiol-Liganden, die eine aufeinanderfolgende kovalente Bindung von Alkin-terminierten siRNA-Duplexen durch kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition ermöglichten. Die Analyse des AuNP-Kerns erfolgte mittels Transmissionselektronenmikroskopie (HR-TEM). Die Beladung mit Bax- oder BAK-siRNA wurde mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) und UV-Vis-Spektroskopie (UV-Vis) bestimmt. Zur Inkubation wurden 0,2 µmol/l Au-siRNA hinzugefügt (bis zu 96 Stunden, 70% Konfluenz, 37°C, 5% CO2, HCEC-12; DMSZ). Die EC-Lebensfähigkeit wurde mit MTS getestet. Selektive Knockdowns unter Verwendung von 1. Kontrollen ohne AuNP, 2. Kontrollen mit Nicht-Ziel-siRNA (NT), 3. proapoptotischen Proteinen Bax und BAK in EC – und deren Apoptoseraten – wurden mittels Durchflusszytometrie (AnnexinV/PI) und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (cLSM, TUNEL-Assay) analysiert – in unbehandelten EC und in solchen nach Apoptoseinduktion mit Etoposid (42,5 µM, 21 h).

Ergebnis: AAS und UV-Vis zeigten 5–10 siRNA-Moleküle pro AuNP-Oberfläche, HR-TEM ergab überwiegend einheitliche Goldkerne (1,4±0,5 nm Durchmesser). UV-Vis zeigte Absorptionsbanden von 228–303 nm, was kovalente siRNA-Bindungen an Azid-terminierte AuNP bestätigte. AuNP zeigten nach 96 Stunden eine effektive Aufnahme in jede EC. Die Lebensfähigkeit/relative Lebensfähigkeit der EC pro Zelle zeigte keine zytotoxische Wirkung. Die Bax- oder BAK-Expression nach 72 Stunden zeigte einen hochsignifikanten Knockdown in AU-siRNA-behandelten EC (einseitige ANOVA posthoc Bonferroni, *p<0,05). Nachweis von Apoptose: Im Gegensatz zur Kontrolle und NT wurden nach 72-stündiger Behandlung fast keine TUNEL-positiven EC gefunden. Caspase-3 war signifikant reduziert (einseitige ANOVA posthoc Bonferroni, 31,8±3%, p=0,006). Durchflusszytometrie: hochsignifikante Reduktion der frühen Apoptose nach der Behandlung (RM einseitige ANOVA posthoc unkorrigierter Fisher-LSD-Test: *p <0,05).

Schlussfolgerung: Nach unserem Kenntnisstand haben wir als Erste den Schutz von EC durch ultrakleine AuNP nachgewiesen. Wir konnten die Eigenschaften von AuNP in EC und ihre potenzielle therapeutische Wirkung erfolgreich demonstrieren. Dieser neuartige therapeutische Ansatz könnte bei der Lagerung in Augenbanken auf EC angewendet werden und dafür sorgen, dass mehr Spenderhornhäute für Transplantationen zur Verfügung stehen.