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Ziel: Zellkulturen aus Schweineaugen haben großes Potenzial als Alternative zu Tierversuchen (3R-Prinzip) in der Augenheilkunde, da sie dem menschlichen Auge sehr ähnlich sind und als Schlachtabfälle verfügbar sind. Wir haben ein Best-Practice-Protokoll für Schweine-Einzelaugen-Zellkulturen des retinalen Pigmentepithels (RPE) entwickelt. Bei Einzelaugen-RPE-Kulturen wird pro Auge eine Kultur angelegt wird, sodass die Zellen innerhalb einer Kultur genetisch homogen, zwischen den Kulturen jedoch genetisch heterogen sind, was zu einer höheren biologischen Relevanz der erzielten Ergebnisse im Vergleich zu herkömmlichen Zellkulturmodellen führt. Wir haben diese Kultur für die Forschung zur polaren Zellbarriere, oxidativem Stress, Inflammation und angiogener Aktivierung im Hinblick auf die Therapieentwicklung für Netzhauterkrankungen optimiert. So könnten diese u. a. für Fragestellungen zur Altersbedingte Makuladegeneration als Hauptursache für Erblindung bei älteren Menschen in westlichen Ländern genutzt werden.

Methode: Für das polare Barrieremodell wurden Beschichtungen für Transwell-Einsätze (Kollagen, Fibronektin, Laminin, Poly-D-Lysin) und die Möglichkeit einer Serumreduktion (von 10% auf 5% oder 1%) getestet. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) wurde gemessen. Konfluenz, Kulturerfolg, Proliferation und Morphologie/Differenzierung wurden durch Zellzählung, Mikroskopie und ELISA bewertet. Zellparameter, Polarisation und die Expression von Differenzierungsmarkern und Tight Junctions wurden mittels Western Blot, Immunfärbung, Kryoschnitten und CellProfiler-Software bestimmt. RPE-Marker wurden mittels Gen-Array analysiert. Für das oxidative Stressmodell wurden Einzelaugenkulturen mit Stressoren wie Erastin oder Natriumiodat behandelt und mittels Viabilitätstests und qPCR untersucht. Die Parameter Zellwachstumszeit (5, 7 oder 14 Tage), Stimulationszeit (4 oder 24 Stunden), Beschichtung (Poly-D-Lysin) und Serumgehalt (1%, 5%, 10%) wurden getestet. Für das Inflammationsmodell wurden Einzelaugenkulturen mit verschiedenen proinflammatorischen Stressoren (Lipopolysaccharid, Polyinosinsäure:Polycytidylsäure, Tumornekrosefaktor) stimuliert. Anschließend wurden Viabilitätstests, ELISA und qPCR durchgeführt. Die Parameter Stimulationsdauer (1 oder 3 Tage), Beschichtung (Laminin/Poly-D-Lysin) und Serumgehalt (1%, 5%, 10%) wurden getestet. Für das Modell der angiogenen Faktoren wurden die Kulturen mit Noxen für Hypoxie (CoCl2, Roxadustat) stimuliert. Anschließend wurden Viabilitätstests, ELISA und qPCR durchgeführt. Die Parameter Stimulationszeit (4 Stunden, 1 Tag, 3 Tage), Beschichtung (Poly-D-Lysin) und Serumgehalt (5%, 10%) wurden getestet.

Ergebnis: Für alle Modelle sollte ein Serumgehalt von 5% verwendet werden. Für das polare Barrieremodell wird eine Beschichtung mit Laminin empfohlen. Für das oxidative Stressmodell sollten die Kulturen 24 Stunden lang mit Erastin stimuliert werden, um eine letale Dosis von 50% zu erreichen. Hier kann optional eine Poly-D-Lysin-Beschichtung für die Genaktivierung der Superoxiddismutase verwendet werden. Für das Entzündungsmodell sollten die RPE-Zellen drei Tage lang mit Lipopolysaccharid stimuliert werden, ohne Beschichtung. Optional kann das Gen für Interleukin 1 beta durch Verwendung von 10% Serum anstelle von 5% Serum aktiviert werden. Für das Modell der angiogenen Aktivierung sollten die Zellen 24 Stunden mit 50 µM Roxadustat stimuliert werden, ohne Beschichtung.

Schlussfolgerung: Parameter für validierte, reproduzierbare Versuchsprotokolle hinsichtlich polare Barrierefunktion, oxidativem Stress, Inflammation und angiogener Aktivierung wurden für Einzelaugen-RPE-Zellkulturen vom Schwein erstellt. Modelle für multiple Einzelaugen-Kulturen (RPE aus einem Auge aufgeteilt in mehrere kleinere Wells) befinden sich derzeit in der Entwicklung. Mit den Protokollen und Modellen können Fragstellungen und Forschungsprojekte bezüglich Erkrankungen mit RPE-Beteiligung wie Altersbedingter Makuladegeneration nach 3R-Prinzip bearbeitet werden.