¹Zentrum für Orthopädie, Unfallchirurgie und Paraplegiologie, Klinik für Unfall- und Wiederherstellungschirurgie, Heidelberg, Deutschland
²Universität Heidelberg, Medizinische Fakultät Heidelberg, Heidelberg, Deutschland
³Genevention GmbH, Göttingen, Deutschland

Text

Zielsetzung und Fragestellung: Zur Therapie von Pseudarthrosen (PA) ist oft eine Transplantation von autologem Knochengraft (GRA), der aus dem Beckenkamm (BK) oder mittels Markraumaspiration aus langen Röhrenknochen (RIA) gewonnen wird, notwendig. Auf zellulärer Ebene spielt für die Heilung das osteogene Potenzial (OP) von knochenmarksstämmigen mesenchymalen Stammzellen (MSC) eine entscheidende Rolle. Allerdings ist das OP von MSCs aus PA und GRA noch nicht ausreichend erforscht. Diese Studie vergleicht erstmalig in einem gematchten in-vitro Studiendesign das absolute, sowie das auf 104 Zellen normierte OP von PA-stämmigen MSCs mit MSCs aus GRA (RIA+BK).

Material und Methoden: MSC aus Proben von PA (n=18) und GRA (n=18; BK+RIA) von 3 Spendern, wurden über 21 Tage in-vitro osteogen differenziert. Differenzierungsmedium: DMEM low glucose + FCS + 100nM Dexamethason + 50 µM L-Ascorbinsäure + 10 nM Glycerolphosphat. Die Quantifizierung des OPs erfolgte nach 21 Tagen mittels Nachweises des extrazellulären Hydroxylapatits (Labeling mit radioaktivem 99 mTechnetium-Hydroxydiphosphonat (99 mTc-HDP)), Bestimmung von alkalischer Phosphatase-(ALP-)Aktivität, Calcium-(Ca-) und Phosphat-(PO4-)Konzentration im Überstand. Viabilität und Proliferationsbestimmung wurde mit DAPI-Immunfluoreszenz an Tag 21 und WST-1 Assay an Tag 7, 14 und 21 durchgeführt. Das OP wurde zusätzlich auf 104 Zellen genormt. Kontrollgruppe: nicht osteogen differenzierte PA- und GRA-MSC derselben Spender. Statistische Auswertung mittels Wilcoxon-Rangsummentest. Signifikanzniveau p≤0,05.

Ergebnisse: Das absolute OP von PA war sowohl für Früh- als auch Spätmarker an Tag 21 signifikant höher als von GRA: 99 mTc-HDP, ALP-Aktivität, Ca-Konzentration: p<0,001; PO4-Konzentration: p=0,002. Die mittels DAPI gemessene Zellzahl war nach 21 Tagen in PA signifikant höher als in GRA (p<0,001). WST-1 Assay wies an Tag 7 eine signifikant höhere Viabilitätsrate in PA verglichen mit GRA auf (p<0,001). An Tag 14 und 21 zeigten sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich Viabilität. Normierung des OPs auf die Zellzahl erbrachte keine signifikanten Unterschiede beim späten Osteogenesemarker 99mTc-HDP, aber ein signifikant höheres OP in den Frühmarkern ALP-Aktivität, Ca- und PO4-Konzentration im Überstand (p<0,001).

Diskussion und Schlussfolgerung: Das absolute OP sowohl in der Früh- als auch Spätphase von PA-MSC ist signifikant höher als das OP von korrespondieren GRA-MSCs. Entsprechend der fortlaufenden Viabilitätsassays sowie DAPI-Zellzählung nach 21 Tagen ist das höhere OP von PA-MSC auf eine höhere Viabilität und Proliferation von PA-MSC zurückzuführen. Nach Normierung auf 104 Zellen zeigt sich ein vergleichbares OP von MSC aus PA und GRA. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass MSC aus PA-Knochen ein vergleichbar hohes OP wie GRA-MSC besitzen und in-vitro darüber hinaus höhere Proliferationsraten aufweisen, weshalb der Optimierung des lokalen Mikromilieus von Pseudarthrosen eine entscheidende Rolle zugesprochen werden sollte.

Abbildung 1 [Fig. 1]

Tabelle 1 [Tab. 1]