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Einleitung: CRISPR-Cas9 erlaubt die gezielte Modifikation genomischer Loci mit bisher unerreichter Präzision und Effizienz. Frühe Studien zeigten jedoch, dass eine Mismatch-Toleranz zwischen sgRNA und Ziel-DNA zu einer substanziellen Off-Target-Aktivität und damit zu unerwünschten Mutationen führen kann. Gerade für das präzise Genome Editing hereditärer Netzhautdystrophien stellt diese Aktivität eine besondere Herausforderung dar.

Methoden: Ein BRET-basiertes Reportersystem wurde genutzt, um alle 60 möglichen Einzelnukleotid-Substitutionen systematisch in einem zellulären Kontext zu analysieren. Die NHEJ-vermittelte Reparatur von Off-Target-Sequenzen diente dabei als direktes Maß der Mismatch-Spaltungsaktivität.

Ergebnisse: Die Off-Target-Aktivität zeigte ein klares positionsabhängiges Muster. PAM-distal und PAM-proximal lagen die gemessenen Raten bei bis zu 40%, während an den Positionen 6–8 und 14 unabhängig vom Nukleotid keine signifikante Off-Target-Aktivität nachweisbar war.

Diskussion: Mit der hier vorgestellten Mismatch-Analyse aller 60 Nukleotidvarianten einer Cas9-Zielsequenz lässt sich das Off-Target-Risiko therapeutisch relevanter sgRNAs gezielter einschätzen und minimieren, was für das sichere Genome Editing hereditärer Netzhautdystrophien von unmittelbarer Bedeutung ist.

Förderung: DFG Sti 597/7