26rg65
10.3205/26rg65
urn:nbn:de:0183-26rg650
Meeting Abstract
Systematische Evaluierung der positionsabhängigen CRISPR-Cas9-Mismatch-Aktivität mittels eines BRET-basierten Reportersystems
Wimmer
Wimmer
Tobias
T
Gießen
author
Lorenz
Lorenz
A.
A
Gießen
author
Hossfeld
Hossfeld
L.T.
LT
Gießen
author
Ponnam
Ponnam
S.P.G.
SPG
Tezpur University, Assam, Indien
author
Lytvynchuk
Lytvynchuk
L.
L
Gießen
author
Stieger
Stieger
K.
K
Gießen
author
German Medical Science GMS Publishing House
Düsseldorf
610
20260910
germ
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 License.
Dieser Artikel ist ein Open-Access-Artikel und steht unter den Lizenzbedingungen der Creative Commons Attribution 4.0 License (Namensnennung).
M0658
65
Retinologische Gesellschaft
38. Jahrestagung der Retinologischen Gesellschaft
Grundlagen-Session
Badenweiler
20260703
20260704
26rg65
TextEinleitung: CRISPR-Cas9 erlaubt die gezielte Modifikation genomischer Loci mit bisher unerreichter Präzision und Effizienz. Frühe Studien zeigten jedoch, dass eine Mismatch-Toleranz zwischen sgRNA und Ziel-DNA zu einer substanziellen Off-Target-Aktivität und damit zu unerwünschten Mutationen führen kann. Gerade für das präzise Genome Editing hereditärer Netzhautdystrophien stellt diese Aktivität eine besondere Herausforderung dar.Methoden: Ein BRET-basiertes Reportersystem wurde genutzt, um alle 60 möglichen Einzelnukleotid-Substitutionen systematisch in einem zellulären Kontext zu analysieren. Die NHEJ-vermittelte Reparatur von Off-Target-Sequenzen diente dabei als direktes Maß der Mismatch-Spaltungsaktivität.Ergebnisse: Die Off-Target-Aktivität zeigte ein klares positionsabhängiges Muster. PAM-distal und PAM-proximal lagen die gemessenen Raten bei bis zu 40%, während an den Positionen 6–8 und 14 unabhängig vom Nukleotid keine signifikante Off-Target-Aktivität nachweisbar war.Diskussion: Mit der hier vorgestellten Mismatch-Analyse aller 60 Nukleotidvarianten einer Cas9-Zielsequenz lässt sich das Off-Target-Risiko therapeutisch relevanter sgRNAs gezielter einschätzen und minimieren, was für das sichere Genome Editing hereditärer Netzhautdystrophien von unmittelbarer Bedeutung ist.Förderung: DFG Sti 597/7
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