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Zielsetzung und Fragestellung: Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind lipidgebundene Partikel, die von Zellen freigesetzt werden und bioaktiven Moleküle (z.B Proteine, Nukleinsäuren) enthalten und als Botenstoffe in der zellulären Kommunikation dienen. Die pathologisch bedingte Knorpelverkalkung in der Osteoarthritis (OA) korreliert mit dem Schweregrad der Erkrankung. Allerdings gibt es keine Daten ob und welche Rolle EVs in der Knorpelverkalkung spielen. Das Ziel dieser Studie war es, EVs aus verkalkenden Chondrozyten zu charakterisieren und deren Potenzial zur Stimulierung der Chondrozytenverkalkung zu untersuchen.

Material und Methoden: β-Glycerophosphat (10 mM, βGP) diente als Phosphatquelle im Kulturmedium zur Stimulation der in vitro Kalzifizierung von C28-Chondrozyten (n=3) und OA Chondrozyten (n=6 Patienten). Die EVs wurden aus dem Zellkulturüberstand über 21 Tage gewonnen und mit der Nanosight hinsichtlich ihrer Größe charakterisiert. Die Calcein-Färbung diente zur Visualisierung und Quantifizierung der kalziumhaltigen Kristalle in den EVs. Die EVs wurden mittels Western-Blot-Analyse auf EV spezifische Marker (CD9, CD63, TSG101, HSP70, Flotilin) sowie Sortilin und TNAP charakterisiert. Anschließend wurden OA Chondrozyten (n=5, 21 Tage) mit den charakterisierten EVs ohne Zugabe von βGP stimuliert. Um die matrix-assoziierte Verkalkung zu untersuchen, wurden in vitro hergestellte Zellmatrices (n=5) durch einfrieren und auftauen devitalisiert, bevor sie mit EVs stimuliert wurden. Alizarinrot-Färbung diente zur Quantifizierung der in vitro verkalkten Matrix.

Ergebnisse: C28- und OA Chondrozyten kalzifizierten mit einer Zunahme der Alizarinrot-Färbung am Tag 14 und 21 im Vergleich zu Tag 1 (C28: p<0,05, humane OA Chondrozyten p=n.s.). Die Größe der C28 und OA Chondrozyten EVs lag bei 100–300 nm. Die geernteten EVs zeigten einem Anstieg des Calceinsignals (C28: p<0,05 Tag 21 vs Tag 7, OA Chondrozyten: p=n.s.). Die EV spezifischen Proteinbiomarker CD9, CD63, TSG101, HSP70 und Flotilin waren ab Tag 7 in den verkalkten C28- und OA-Chondrozyten nachweisbar. Der Nachweis von Sortilin und TNAP und der kalziumhaltigen Kristalle in den EVs deuten auf deren Rolle in der Gewebeverkalkung hin. Daher wurde das Potenzial der charakterisierten EVs in der in vitro Verkalkung von OA Chondrozyten untersucht. Die EVs stimulierten die Verkalkung von OA Chondrozyten basierend auf einem Anstieg der Alizarinrot-Färbung nach 21 Tagen (p<0,05 im Vergleich zur jeweiligen Kontrollgruppe). Die devitalisierten Chondrozytenmatrices zeigten einen Anstieg der Matrixverkalkung (p<0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe). Die matrixassoziierten Kalzifizierung war geringer als die Verkalkung in der Gruppe mit den nicht devitalisierten Zellen.

Diskussion und Schlussfolgerung: Unsere Daten zeigen, dass EVs von βGP-stimulierten Chondrozyten Kalziumkristalle enthalten. Diese kalziumhaltigen EVs stimulieren die Kalzifizierung von OA-Chondrozyten und deren Matrix in vitro ohne die Zugabe von βGP. Dies unterstreicht die Relevanz von EVs in der Pathogenese der Kalzifizierung in OA-Gewebe.